消泡剂在生物发酵行业的应用

作者:admin 发布日期: 2020-05-28 二维码分享
上文我们已经简单介绍了消泡剂的一些基本知识,大家应该已经知道了什么是消泡剂,消泡剂的消泡机理,那么针对不同的行业怎样选择合适的消泡剂呢?
下面让我们一同进入生物发酵行业,来打开消泡剂在这个行业中应用!
消泡剂因其使用方便,成本低廉,能耗少而在发酵工业中得到广泛应用。每种消泡剂都具有一定的消泡效果,但也都有可能对培养环境以及细胞生长产生有利或有害的影响,进而影响目的产物的合成。因此,在选用消泡剂时要综合考虑其种类、功能、添加浓度及其对发酵过程产生的影响,以达到.佳的效果。 
消泡剂也称消沫剂,是在食品加工过程中降低表面张力,抑制泡沫产生或消除已产生泡沫的食品添加剂。我国许可使用的消泡剂有乳化硅油、高碳醇脂肪酸酯复合物、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚、聚氧丙烯甘油醚和聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚、聚二甲基硅氧烷等7种。目前,消泡剂被广泛应用于医药行业及调味品、乳制品、豆制品、饮料、制糖业、酶制剂等食品工业;然而,消泡剂的添加往往根据经验确定,很少有理论或数据来支撑。
泡沫可定义为液体介质中稳定的气体,是一种气体在液体中的分散体系,气体成为许多气泡被连续相的液体分隔开来,气体是分散相,液体是分散介质。目前,在单克隆抗体、重组蛋白、抗生素、酶制剂、有机酸、燃料乙醇等的发酵生产过程中,由于通气、搅拌、培养基中糖和蛋白质的存在、细胞及代谢产物的积累等原因必然产生大量的泡沫。这些泡沫的存在对微生物培养过程、菌体收集、产物分离等工序都会产生影响。大量持久的泡沫如不能及时消泡,会造成罐内供氧量不足,尾气过滤器堵塞,罐压升高,菌体生长和产物合成抑制,甚至会发生逃夜现象,降低发酵设备装料系数和利用率,增加染菌风险。若不能很好地解决泡沫问题,将会对发酵工业造成巨大影响。那么怎样防止泡沫的形成呢?方法有两种:一种是机械消泡,一种是化学消泡——添加消泡剂。由于机械消泡效果欠佳、易受环境制约、投资大,目前已少有厂家使用。消泡剂具有消泡速度快,效果明显等优点,广泛用于发酵工业中。国内外有关消泡剂使用的文献较多,已有研究表明消泡剂会导致流体动力学特性和传质性能的降低,对细胞生长速率,细胞形态和产物合成产生影响,这些影响可能有利于可溶性蛋白质的表达系统,如增加α-淀粉酶和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的分泌,或通过生物量增加而实现更高的蛋白产量。然而,在某些情况下,消泡剂可能对细胞和蛋白质表达产生不利影响,并且这种影响根据所表达的蛋白质不同而变化。目前的研究都是片段化的,还没有学者对消泡剂在发酵过程中的应用进行系统的研究与总结。
消泡剂的性能主要体现在消除已产生的泡沫和抑制泡沫形成两方面。目前对于消泡剂的性能评价还没有统一的标准,主要是在实验中相互比较来评判。消泡剂性能测试的方法主要有循环鼓泡法、振荡法、罗斯-迈尔斯法、高速搅拌法、泵循环喷射法。这些方法都是利用泡沫体积的变化来比较消泡剂的消泡性能,只是消泡剂的加入时机有所不同。国内生物发酵行业主要采用循环鼓泡法来测试消泡剂的性能。
消泡剂性能测试结果受到测试方法、测试液、测试体积、消泡剂种类、消泡剂浓度及添加量等多种因素的影响,不同的测试环境中可能会得到不同的结论,因此无法宏观的去比较消泡剂性能,必须根据具体实验条件选择合适的测试方法,以获得.佳结果。
消泡剂对原核生物发酵的影响
魏浩等研究发现,聚醚类消泡剂能显著促进植物内生菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2的生长,发酵24 h时菌体干质量为对照(未添加消泡剂)的21.4倍,而豆油能够促进抗菌肽的合成,其表面活性肽(surfactin)和(fengycin)的含量分别是对照的24.61倍和13.29倍。崔耀军通过小试和工业化批次生产实验发现发酵专用消泡剂LB-625对菌体基本无影响,跟敌泡和有机硅消泡剂相比,对中温α-淀粉酶酶活力有一定提高。ANDERSSONE等考查不同浓度的PEG3350和PEG600对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacil-lus amyloliquefaciens)合成α-淀粉酶的影响。研究发现在添加8%PEG600及5%PEG3350条件下,枯草芽孢杆菌合成的α-淀粉酶增加1倍,而添加9%PEG3350抑制α-淀粉酶合成,此外,添加20%PEG600能够促进枯草芽孢杆菌合成α-淀粉酶,但抑制解淀粉芽孢杆菌对α-淀粉酶的合成。进一步研究发现细胞形态在双水相体系发生变化,PEG可能与细胞壁相互作用,使枯草芽孢杆菌细胞变得更亲水,解淀粉芽孢杆菌细胞变得更加疏水。PEG对两种芽孢杆菌影响差异可能是由于对细胞壁或膜的作用造成。RAO J L U M等[36]研究了不同分子质量的PEG对地热芽孢杆菌分泌α-淀粉酶的影响。研究发现0.5%分子质量>4 000 Da的PEG导致α-淀粉酶比活降低,效价增加;而较低分子量的PEG导致α-淀粉酶比活增加,效价降低。当PEG浓度>0.5%时,α-淀粉酶的产量下降。作者认为α-淀粉酶效价的增加可能是由于生物体膜磷脂的改变,提高了酶的分泌。KOCH V等研究发现,S184(硅油),SLM54474(聚丙二醇(poly propylene glycol,PPG)),VP1133(硅油/PPG混合物)对菌体生长(菌体浓度、比生长速率、葡萄糖消耗)及产物合成没有显著影响;而SE9(10%S184)能够显著促进大肠杆菌(Escherichia coli)K12的生长及产物合成,其菌体浓度是其他消泡剂的2倍左右。SLM54474、S184、VP1133、对产物活性也有一定的影响,随着SLM54474 及VP1133浓度的增加而β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,随着S184浓度的增加而β-半乳糖苷酶活性逐渐降低。刘跃等研究发现,在发酵培养基中0.10%的磷酸三丁酯和0.06%THIX-298 聚醚改性硅油能显著提高埃博霉素A/B(分别提高 31.41%/18.05%和48.12%/ 48.55%),其他消泡剂对菌体和产量影响较小。为了探究消泡剂对纤维堆囊菌生长和埃博霉素产量提高的原因,作者对发酵过程中的pH、还原糖、氨基酸态氮,α-酮戊二酸脱氢酶复合体(oxog-lutarate dehydrogenase complex,OGDHC)酶活进行检测,发现THIX-298聚醚改性硅油能够促进菌体对氨基氮和还原糖的利用,pH环境变化也较为缓和,从而使菌体量增加,相应的埃博霉素产量也得到提高,说明THIX-298聚醚改性硅油提高埃博霉素的原因与提高菌体量有关。
消泡剂对真核生物发酵的影响
马晓梅等在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基中分别加入0.1%、0.4%、0.7%(V/V)的10种消泡剂,考察消泡剂对棘孢木霉菌株Tr148c生长的影响,结果发现天然油(豆油)、聚醚类(GPE-6330,GP-6301)和有机硅类(L-101a、L-104a)对Tr148c的菌丝生长抑制作用显著弱于其他消泡剂(P<0.05)。在 10 L发酵罐中进行108 h的发酵验证,L-101a的产孢量(2.25×108个/mL)显著高于L-104a(1.45×108个/mL)和GPE-6330(1.65×108个/mL)(P<0.05)。HOLMES W等[38]研究发现,酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母在摇瓶培养基中表达重组Fc融合蛋白都受到消泡剂类型、浓度以及所用培养基的的影响,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的生物量随着J673A消泡剂浓度(0~8%)(V/V)的增加而增加;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物量随着SB2121消泡剂浓度(0~8%)(V/V)的增加而降低;8%的消泡剂C对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生长没有影响。虽然高浓度的消泡剂能够促进细胞生长,浓度>1%的消泡剂就会引起重组蛋白质表达量下降。覃先武等研究消泡剂对面包酵母发酵产量和酵母活力的影响中也有类似发现,J763消泡剂对酵母生长基本没有影响,获得的干酵母活力达到730 mLCO2/h,而GPE5005、PPG2000及二甲基硅油对酵母生长的抑制作用逐渐增加,获得的干酵母活力也逐渐降低。MUKAIYAMA H等研究发现,0.1% 的 PEG8000 能够改善人转铁蛋白(human transferrin,HTF)的分泌,而1%的PEG8000对细胞生长有抑制作用。hTF分泌增加是由于PEG改变了细胞的磷脂组成。ROUTLEDGE S J等研究了5种消泡剂对巴斯德毕赤酵母生产重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的影响。发现添加0~1%)(V/V)的消泡剂A、消泡剂C、J673A、P2000、SB2121会增加重组GFP的表达量,P2000、SB2121和J673A促使GFP表达量几乎增加1倍。然而只有消泡剂A,消泡剂C和J673A组的GFP的单位菌体产率增加,这表明由于添加P2000和SB2121组GFP总产量的增加可能是因为细胞的生长特征的改变。添加0.8%消泡剂C组在对数期的比生长速率.慢,而J673A、P2000和SB2121组生长速率较高。作者采用碘化丙锭排除和流式细胞术测量,发现消泡剂不影响细胞的活力及培养基中的溶解氧浓度。通过比较流式细胞术检测细胞中保留的GFP与荧光测定法在培养基中保留的GFP,发现消泡剂A,消泡剂C或J673A是通过增加分泌到培养基中的比例来增加GFP的特定产率。随后,该学者又将GFP研究中筛选出的.佳消泡剂浓度应用于人腺2a受体(human adenosine 2a receptor,hA2aR)的表达研究,发现该浓度的消泡剂虽然有利于GFP的表达,但是对hA2aR的表达产生不利影响,目的蛋白产率低于对照组[3]。
消泡剂对哺乳动物细胞发酵的影响
VELUGULA-YELLELA S R等研究了非有机硅类(消泡剂204)和有机硅消泡剂(消泡剂C,SE-15,Y-30和EX-Cell)在ProCHO 5,PowerCHO 2和EX-Cell Advanced三种培养基中对CHO DG44细胞生长和嵌合 IgG1抗体产量的影响。研究发现消泡剂204和Y-30对细胞有毒性并抑制细胞生长,含Y-30消泡剂的Power-CHO 2培养基中细胞能存活,但活细胞密度积分(integral of viable cell density,IVCD)和比生产率显著低于消泡剂C(P<0.05),EX-Cell和SE-15组。消泡剂C,EX-Cell和SE-15的IVCD为15~35×106个细胞(/mL?d),比生产率为1.5~2.3 pg/(mL?d)。消泡剂C在ProCHO 5和 PowerCHO 2培养基中具有较高的滴度,而EX-Cell消泡剂在EX-Cell Advanced培养基中具有较高的滴度。除了PowerCHO 2培养基中,消泡剂C在ProCHO 5和EX-Cell Advanced培养基中具有较高的比生产率。
消泡剂可以影响细菌、酵母和CHO细胞的生长以及产物合成,提高培养物的生长速率可提高产量。ROUTLEDGE S J等[18]研究发现,0.6%消泡剂A,1%J673A,1%P2000和1%SB2121组的比生长速率生长较对照高,GFP表达量也显著高于对照组(P<0.05)。然而,也有研究发现.大比生长率与.大比生产率并无相关性,高水平的蛋白表达可能导致比生长速率降低。这可以解释添加0.8%消泡剂C酵母生长速度低于对照,但GFP表达量更高;随着SLM54474浓度的增加,大肠杆菌的生长速度下降,但酶的效价增加。终上所述,消泡剂是否会对细胞的生长和产物合成产生影响取决于所使用的消泡剂类型和浓度。
消泡剂对细胞的影响
刘跃等研究表明,消泡剂可以通过改变细菌和酵母细胞膜的状态来改善了目的产物的分泌,或者提高细菌和酵母的生物量来增加目的产物的合成。这与之前的研究结果一致,该研究表明消泡剂可通过扰乱甾醇生物合成来改变膜的渗透性,进而影响酵母细胞的渗透性。甾醇作为酵母质膜的主要成分具有极性羟基的刚性疏水分子,有助于维持膜的结构。膜流动性对于营养摄取和底物交换很重要,并影响膜蛋白和插入位点的运动和活性。结合流式细胞术和荧光测定发现消泡剂可以影响保留在酵母胞内和分泌到培养基中GFP的量。.近还显示,巴斯德毕赤酵母的麦角甾醇生物合成途径的改变与重组蛋白分泌的增加有关。
有研究表明植物油可以作为碳源被代谢,但没有关于其他消泡剂被代谢的报道。对于消泡剂提高生物量的机制有待进一步研究,有些生物可能能够利用消泡剂来增强生长和合成产物的能力。
消泡剂的选择
应用于发酵过程的消泡剂通常要符合以下4点要求:
1、 必须是强表面活性剂,具有较低的表面张力,能够在泡膜上浸入及扩展;
2、 分散性较好,对发酵液有一定的亲和性,能够迅速分散于发酵液中,对泡沫起作用;
3、 对菌体生长、目的产物合成及提取无影响或影响较小;
4、 难溶或不溶,且挥发性小,具有持久的消泡和抑泡性能。
发酵行业中消泡剂的筛选过程: 对消泡剂的物理性质进行检测,包括性状、在水,醇类,酸碱中的溶解度、浊点等; 选择合适的方法进行消泡剂的性能测试; 根据性能测试结果进行摇瓶实验,考察消泡剂对菌体生长及产物合成的影响,同时筛选适宜的消泡剂添加量; 摇瓶和发酵罐的搅拌模式平及溶氧水不同,摇瓶实验结果往往不能准确预测发酵罐上的情况,因此,需要进行上罐验证,同时考察消泡剂的添加方式(灭菌前加入、接种前加入、发酵过程流加等); 确定合适的消泡剂,再参考价格,挑选出.经济的消泡剂。